肝细胞癌的基因治疗

肝细胞癌的基因治疗
　　肝细胞癌(hcc)是世界上一些地区最常见的恶性肿瘤之一，预后极差。肝细胞癌发生的分子机制核心是多种基因突变和遗传不稳定，这些情况大多数来自慢性肝脏病及相关的肝细胞再生及有丝分裂活性增强。　　hcc的基因治疗可分为三类：基因替代或修复，基因增强，dna疫苗。由于肝细胞肿瘤发生的遗传改变非常复杂，目前大多数研究集中于基因增强作为实验性治疗的策略。编码细胞因子如il-2、il-4或α-ifn的基因，能诱导增强或放大对hcc细胞的免疫反应；“自杀基因”编码的酶能催化无毒的药物前体转化为细胞毒性物质，使转导的恶性细胞对无毒的药物前体敏感。在某些与肿瘤抑制基因p53突变相关的恶性肿瘤中，导入野生型p53基因可使肿瘤对化疗药物敏感，此外dna疫苗可以用来诱导抗hcc特异性抗原的细胞毒性免疫反应。理论上基因治疗也可以包括诱导肿瘤休眠状态的策略，包括抗血管形成的疗法。　　尽管基于核苷酸的hcc治疗具有令人鼓舞的前景，但在这些概念被应用于临床之前仍必须致力于不同的给药途径、靶细胞及安全性等方面的问题的研究。显然，分子医学和基因治疗正在成为我们治疗病人的手段，而且最终将完全成为或部分取代现有的治疗策略。　　除了继续发展和探索新的hcc治疗策略，应用现有的方法防止hcc发展仍十分重要。这些包括全球儿童乙肝疫苗免疫接种，减少黄曲霉素对食物的污染，降低酒精的摄入，血色病患者放血治疗减少铁离子的过多负荷，治疗乙肝、丙肝等。因此，预防措施仍是影响全球一个最常见而且极其恶性的hcc发病率的主要因素。前　言　　肝细胞癌是世界上最常见的肿瘤之一，估计每年新发病例在50～100万之间，尽管在美国及欧洲发病率较低，但在亚洲及撒哈拉非洲的某些地区每年每10万人中有500例新发病例。发病率如此高的原因是乙肝或丙肝病毒的慢性感染及乙肝-丙肝混合感染，hbv和hcv感染的临床病程部分与这些病毒的分子特征，部分与病人的hla单倍型，部分与其它的协同高危因素有关。已知与hcc发病相关的外源性非病毒因素是酒精和黄曲霉素。在西方国家，酒精引起的肝损害是引起肝硬化的主要原因，也是hcc发生的最重要危险因素。在中国南方地区和非洲饮食含有高水平的afb1是hcc发生的特殊环境公害，对慢性hbv携带者尤其危险。其它也可引起hcc发生的外源性因素，包括饮食铁过量负荷，长期应用口服避孕药及高剂量的合成代谢类固醇。肝硬化的发生，尤其是伴有遗传性疾病，如a1-抗糜蛋白酶缺陷症或血色病，大大增加了肝细胞恶性转化的危险性。由于70%～90%的hcc来自大结节性肝硬化，肝硬化是hcc发生的主要临床危险因素。另外，hcc在男性比女性常见，在过去数十年发病率普遍增加，而且随年龄而增高。　　肿瘤分子致癌机制的核心是原癌基因和肿瘤抑癌基因突变，及细胞dna遗传不稳定性，包括错配修复缺陷及染色体分离。在肝癌发生过程中，这些遗传变化发生在伴有肝细胞再生及有丝分裂速度加快的肝细胞受损和坏死部位，引起肝细胞慢性轻度损害及有丝分裂的任何外源性因素，包括病毒性及其他因素，均是显著增加hcc发生的潜在危险因素，这些因素使肝细胞dna易发生其他遗传改变。总之，有多种分子机制，其中环境及病毒致癌物hcc发展中可能起着重要作用。　　hcc病人的预后一般极差，大多数研究报告有hcc症状的病人的5年生存率不足5%，而且，这些肿瘤对放疗和化疗均有抵抗。对hcc自然病史和临床病程的研究发现生存期较长的病人只是那些症状轻微的hcc患者，其病变能够手术切除或用非手术干预疗法治疗。　　过去数年分子诊断及分子治疗是生物医学及临床医学研究的主要问题。对人类许多疾病的分子及遗传基础的认识，不仅使我们对他们的发病机制有了更好的理解，而且还为我们诊断防治这些疾病开创了新的前景。本文主要介绍基因治疗恶性肿瘤的一些基本概念，为hcc的分子治疗和预防，对基因替代或修复、基因增强和基因疫苗疗法作如下阐明和探讨。基因替代或修复　　现已明确，遗传学上单个基因缺陷的累积是肿瘤发生过程中的重要步骤。在这种情况下，治疗的目的是通过有目的地用相应的正常同源性基因，产生生理性基因产物，或修复缺陷基因，纠正基因缺陷。由于正常细胞中基因调节非常复杂，因此，理论上非常简单的方法却难以有效地移植到实验上或临床中应用。不过，为恢复缺陷基因的正常功能，人们探讨了多种具有意义的实验策略。　　引起人们最大兴趣的肿瘤基因治疗是恢复肿瘤抑制功能，例如利用多种基因转移方法转导野生型p53进入肿瘤细胞。p53肿瘤抑制基因突变在hcc中很常见，尤其在hbv感染及在暴露黄曲霉b1 hcc高危因素地区。野生型p53蛋白功能丧失与肿瘤恶性表型有关，含p53突变的肝细胞有特殊的生长及存活优势，对多种化疗药物的耐受性增加。相反，转导野生型p53基因到带有p53突变的hcc细胞，可以导致细胞的生长受抑制，并恢复对化疗药物的敏感性。这种方法在体外已有成功的报道，通过逆转录病毒将野生性p53基因介导入hcc细胞，引起组织特异性生长抑制以及对顺铂（cisplatin）敏感。已有小鼠胃癌模型导入野生型p53进行体内基因治疗获得令人鼓舞疗效的报道。　　1型遗传性高酪氨酸血症（hereditary tyrosinrmia type i）是一种肝脏的酶缺陷的疾病，易发生hcc。在高酪氨酸血症的动物模型中已经显示了基因替代的巨大潜力，在这一模型中，用逆转录病毒将基因转导至肝脏，结果只有少数肝细胞被转入基因。由于被转导的肝细胞的正性筛选，在8～12周内80%以上的肝细胞内含有治疗性基因，这一研究很好地证明了基因替代结合正性筛选可能成为预防hcc 发展的方法。因此，转导既是治疗性的，又是标记基因进入同样的靶细胞，在有成效地选择被转导细胞的条件下，使少数被转导的肝细胞在肝脏内可能重新复制成群体。　　基因替代治疗肿瘤的1个主要限制是大分子dna投药构建的药代学特征不理想，其结果是只有少数的靶细胞被转导。一个新颖克服这一问题的方法是用p53突变来筛选腺病毒所介导的肿瘤细胞溶解。这是构建一种能选择性地在p53缺陷人类肿瘤细胞中复制的腺病毒突变体；另一种方法是将目的基因与能在细胞-细胞间转导的蛋白质，例如与?型单纯性疱疹病毒病毒颗粒蛋白vp22融合，刺激治疗基因在细胞内的传输。　　最近有报道基因替代之外细胞内修复dna或rna突变的另一策略，是用寡核苷酸做位点导向修复点突变。例如在rna水平上，?类反式剪切（trans-splicing group i）核酶表明能特异的修饰细胞rna的种型。基因增强　　基因增强旨在局部表达一种治疗基因，而这种基因在生理下不表达或表达的量达不到治疗水平。这种方法也用来研究恶性疾病的治疗，这种治疗方法的原理是直接用自杀基因杀死靶细胞或用免疫刺激性细胞因子如il-2或tnf-α间接清除靶细胞。　　一种新的增强免疫介导治疗方法是将超抗原转染到肿瘤细胞中，它能强效地抗肝细胞癌。通过全身性投入逆转录病毒或腺病毒载体，或直接在注入肿瘤或腹膜腔内给予逆转录病毒在活体获得基因转染成功。原则上，基因转染也可以在活体体外（ex vivo）进行，即将治疗基因转入从肝癌病人分离出的肿瘤浸润淋巴细胞(tils)，在体外使tils增殖然后再将活体体外修饰的tils回输给病人。　　另一种治疗肝细胞癌的策略是药物前体激活疗法，将自杀基因转入肿瘤细胞然后给予药物前体。例如，给予能编码水痘疱疹病毒或单纯疱疹病毒胸苷激酶（vzvtk或hsvtk）基因，再给予更惜洛韦（ganciclovir），后者能在转染的细胞中转化为三磷酸更惜洛韦, 导致αdna多聚酶被抑制，dna链被终止，从而使靶细胞被杀死。已有报道证实用α-tnf 和il-2在体内能将小鼠肝细胞癌完全逆转。　　这种药物前体激活策略具有以下优点：即治疗强度及持续时间可以在一定程度上通过给予的前体药物浓度来控制。这种想法已经用于肝细胞癌的体外和体内的实验治疗，例如，用hsv-tk基因及编码胞嘧啶脱氨酶的基因将药物前体5-胞嘧啶转变为5-氟尿嘧啶，后者抑制细胞周期s期的rna及dna合成。自杀基因表达导致明显的旁观者效应已在体内外得到证实，它是由于细胞-细胞接触而不是转染的细胞释放细胞毒性物质所致。同时，旁观者效应可以影响靶组织内非肿瘤细胞的分裂，这可能会限制该方法在临床上的应用。dna疫苗　　直接将基因转入肌肉是基因治疗应用的一令人鼓舞的新进展。治疗性dna疫苗在细胞内合成质粒表达的蛋白，该蛋白进入mhc ?类和?类途径。只有源于细胞内的蛋白能被mhc ?类分子处理，后者则将蛋白片段带至细胞表面。在细胞表面刺激cd8+细胞毒性t细胞，引起细胞介导的免疫反应。理论上，这种方法可以用于治疗与疾病特异性抗原过表达相关的疾病，与疾病相关的特异性抗原包括肿瘤特异性抗原，后者可以作为cd8+ctl作用的目标。　　基于dna的肿瘤疫苗抗原发性肝细胞癌是可行的，例如，肌肉内给予表达肝细胞癌特异性抗原或在肝细胞内高度过表达抗原的质粒，如af-20抗原、胰岛素受体底物-1、α-fp、天门冬氨酰天冬酰羟化酶（aah），突变的p53或其它蛋白。这种策略应用可能出现的问题是免疫应答的调节及非肿瘤细胞也出现低水平靶抗原表达，使它们也同时易被免疫介导的反应清除，而且现在认为，出现肿瘤时可能已经过免疫筛选，导致对宿主肿瘤抗原本身的免疫源性低下。总结及展望　　肝细胞癌是世界上某些地区最常见的恶性肿瘤之一，预后极差。hcc发生的主要流行病学危险因素包括毒素（酒精，黄曲霉毒素b1），雄激素及雌激素，hbv及hcv感染，许多遗传性代谢异常，如α-1抗胰蛋白酶缺陷及血色素沉着病。　　hcc发生的分子机制非常复杂，包括许多抑癌基因、原癌基因结构或表达改变、基因错配、修复能力缺陷或染色体不稳定导致的遗传不稳定以及染色体分离缺陷导致非整倍体（aneuploidy）等。hcc发病分子机制的核心是多种基因突变及遗传不稳定，大多数情况发生于慢性肝病及与之相关的肝细胞再生及有丝分裂活动增加。　　hcc的基因治疗分3类：基因替代或修复，基因增强和基因疫苗。由于肝细胞癌发生的遗传因素非常复杂，迄今许多研究集中于基因增强作为实验性治疗策略。向肿瘤细胞内或自身tils内导入编码细胞因子的基因，如il-2、il-4或tnf-α是针对肝癌细胞导入、增强或放大免疫反应的一个策略。另一种方法包括在肿瘤细胞中导入自杀基因，如编码hsvtk的基因，它能催化更惜洛韦转化为细胞毒性的三磷酸，导致转染的肿瘤细胞对无毒的前体药物敏感。在一些与肿瘤抑制基因p53突变相关的恶性表型中，导入野生型p53基因能恢复细胞对化疗药物的敏感性。而且，能够在p53基因缺陷的肿瘤细胞内复制并裂解该细胞的腺病毒突变体也可以用做治疗方法。dna疫苗可以用来引起抗肝细胞癌特异性抗原的免疫反应。理论上，基因治疗还包括旨在引起肿瘤休眠的方法，包括抗血管形成治疗。　　尽管基于核苷酸的肝细胞癌治疗方法有诱人的前景，但在其进入临床应用之前，还需要弄清给药途径、目标及安全性等问题。我们知道，分子医学及基因治疗正变成治疗病人方法的一部分，它将最终完成并部分代替现有的防治方法。　　最近，基因治疗领域进展很多，这些方法在将来可能也有益于肝细胞癌的治疗，体循环给予腺病毒的一个主要副作用是由于转染的肝细胞表达的病毒蛋白引起的炎症反应。肝脏再生也使健康组织对自杀基因的毒性敏感。因此，构建一种无害的去掉所有病毒蛋白的腺病毒载体还有很长的路要走。这些载体的免疫原性大大减弱将显著降低前述的副作用。　　腺病毒载体感染特性的研究领域进展也很大。这对于强毒性自杀基因的应用尤为重要。用一种腺病毒结合抗体可成功地将腺病毒的嗜性改变，这种抗体与配体共轭结合，而配体与靶细胞受体具有高亲合力。最近，人们试图将新的配体直接连接到腺病毒纤维结中。将来，这种方法将最可能用于发现肝细胞癌抗原。　　正如用尿激酶转基因鼠及fah基因敲除鼠所证实的，用经过遗传矫正的细胞重新进入肝脏，将用于肝细胞癌的预防。将来可能用抗病毒感染，复制或基因表达的经遗传矫正的肝细胞重殖于肝脏，预防肝硬化及肝细胞癌的发生。　　对于免疫介导的基因治疗，使用超抗原增加t细胞克隆，将比单独表达细胞因子更有效地抗肿瘤。以后，将探索使用抗肝细胞癌特异性抗原的高亲和力t细胞受体作为基因治疗的策略。　　除了发展和探索新的肝细胞癌治疗方案，完善现有的方法来预防肝细胞癌的发生是最重要的。实际上，在台湾儿童中普遍使用乙肝疫苗已经使肝细胞癌的发病率下降了。将来，慢性乙肝、丙肝的治疗将有利于防止肝细胞癌的发生。公共卫生手段减少食物被黄曲霉毒素污染及防止酒精过量将进一步减少慢性肝病及肝硬化的发生。其它外源的介质如长期使用高剂量的雄激素或其它合成的甾体激素也应避免，甚至对某些遗传性的疾病，例如放血降低铁负荷已经证实可防止血色病向肝硬化和hcc发展。因此，预防措施将是影响肝细胞癌发病的主要因素。